科研 | Acta Neuropathol Commun：重复性的轻度创伤性脑损伤引发长期和持续的行为缺陷和病理改变

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编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

我们以前曾用磁共振波谱（MRS）、弥散张量成像（DTI）和功能磁共振成像（fMRI）研究了非脑震荡大学生橄榄球运动员大脑的长期变化。另一些人报告说，接触性运动运动员的认知缺陷不符合脑震荡的诊断标准。这些结果表明，重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBIs）的严重程度不足以达到脑震荡的诊断阈值，会产生长期的后果。我们试图描述rmTBI小鼠模型的神经影像学、认知、病理学和代谢变化。我们使用一个闭合颅骨的mTBI模型，当将其按比例放大到类似于人体时，其旋转加速度和线性加速度远低于运动员的脑震荡，我们发现每天5次mTBI会触发两种不同类型的病理变化。首先，在损伤后的最初几天和几周内，rmTBI产生了弥漫性轴索损伤，一种短暂的炎症反应和弥散张量成像（DTI）的改变，随着时间的推移而消失。其次，rmTBI导致了损伤后数月内明显的病理变化，包括：磁共振波谱（MRS）的变化、突触蛋白水平的改变、注意力和空间记忆的行为缺陷、病理磷酸化tau的积聚，血液代谢谱改变和白质超微结构异常。这些结果表明，在小鼠中，极轻微的rmTBI会触发过程，并在最初损伤数月后观察到病理后果。

论文ID

原名：Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes译名：小鼠中重复性的轻度创伤性脑损伤引发一系列缓慢发展的长期和持续的行为缺陷和病理改变
期刊：Acta Neuropathologica Communications
IF：7.804发表时间：2021.04通讯作者：Arthur Brown
通讯作者单位：韦仕敦大学

实验设计

实验结果

1. mTBI的头部运动学
如前所述，撞击过程中头部运动学的变化通过高速摄像（图1a）进行评估。平均峰值线性位移为1.3±0.4 mm（图1c）。平均峰值线速度和线加速度分别为0.35±0.07 m/s和14.0±2.2 g（图1d，e）。平均峰值角速度和角加速度约为50.6±24.6 rad/s和36.6±24.5 krad/s²（图1f）。这些线性和角加速度远低于其他研究TBI的人用小鼠嵌合体模型或大鼠mTBI体重下降模型测得的线性和角加速度。此外，当使用比例因子λ =(人脑质量/小鼠脑质量)^1/3=13.8，本研究中使用的mTBI估计在小鼠脑中产生的力比在经历脑震荡的运动员脑中产生的力小40倍。所有随后的实验都使用这些参数，每天重复一次损伤，连续5天。 图1 mTBI期间头部运动
a，使用两个标记对头部运动进行高速摄像跟踪。b，照片显示了在F1、F2和F3帧拍摄的碰撞过程中头部的位置。F0是鼠标头部在撞击前的一帧。鼠标头部在撞击后立即显示弯曲（a中的F1帧和图f中的标记1），然后显示轻微伸展（a中的F2帧和图f中的标记2），再分别显示轻微弯曲（a中的F3帧和c-e和f-h中的标记3）。 2. rmTBI引起弥漫性轴索损伤
弥漫性轴索损伤（DAI）是mTBI常见的神经病理学后果。DAI的主要结果是轴突运输中断，导致退化的细胞物质积聚成肿胀，可通过银染色检测。为了评价rmTBI损伤是否引起DAI，我们对损伤后48 h、1、4和10周的rmTBI小鼠脑组织切片进行了银染。银染切片检查显示，在分析的所有时间点胼胝体都有较强的银染（图2e-h）。高倍镜显示，银染轴突具有与DAI相关的典型串珠状外观。对照组小鼠的脑切片未显示任何银染轴突，而在单次mTBI后一周的小鼠显示偶有银染阳性轴突（图2b-d）。免疫组化检测淀粉样前体蛋白（APP）在轴突的积聚也被用来作为DAI的一个指标。APP在损伤后数小时内积聚在受损轴突中，与银染相比，APP免疫反应显示轴突病理程度更高。因此，我们评估了rmTBI小鼠脑组织中APP的免疫反应性。尽管对照组切片（图3a，b）未能显示APP免疫反应的显著水平，但在损伤后48 h和1周，rmTBI小鼠的PFC和胼胝体中很容易看到APP积聚（图3c，f）。研究表明，APP不仅在轴突损伤部位积聚，而且在TBI后其表达水平也增加。mTBI小鼠蛋白提取物的Western blot分析显示，损伤后8 h、48 h和1周时，损伤小鼠PFC中的APP蛋白水平显著高于假手术小鼠（图3k，l）。图2 rmTBI后胼胝体弥漫性轴索损伤。
a，H&E染色显示胼胝体区。b、c，所有切片均可见细胞核银染，而对照组切片未观察到银染纤维。d单次mTBI后的小鼠具有较少的银染纤维。e-h损伤后48小时、1周、4周和10周的rmTBI小鼠切片均可见典型DAI点状串珠的银染纤维。 图3 淀粉样前体蛋白（APP）在rmTBI后上调
a-j，代表性免疫组化显微照片显示，对照组（a，b）和rmTBI后48 h（c，d）、1周（e，f）、4周（g，h）和10周（i，j）的胼胝体和前额叶皮质中APP表达（箭头）。k，l最后一次假手术后48小时，假手术小鼠皮质和rmTBI小鼠在rmTBI后8小时、48小时、1周和20周的全长度APP的western blot和密度分析显示，伤后8小时、48小时和1周的APP水平显著增加，并在伤后20周恢复到基线水平。 3. rmTBI诱发短暂胶质细胞增生和炎症
通过免疫组织化学和western blot分析评估星形胶质细胞和炎症对rmTBI的反应。我们先前通过免疫组织化学和western blot分析证实，在持续数月的轻度外侧液体冲击损伤后，星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生持续时间延长。与损伤后48小时恢复到基线水平的假手术组相比，此处使用的重复mTBI损伤在损伤后8小时产生了两倍的GFAP表达的瞬时增加（图4a）。小胶质细胞的标志物Iba1水平也在最后一次5 mTBIs后8小时升高，我们通过Western blot分析进行评估，并在48小时恢复到基线水平（图4b）。使用Iba1抗体的免疫组织化学显示，虽然假手术对照组的小胶质细胞具有静息小胶质细胞的典型分支外观，但在最后一次mTBI后48小时，受伤小鼠的小胶质细胞呈现出更圆润和浓密的外观，在受伤后1周恢复到基线静息状态（图4e-h）。通过western blot检测，PFC中促炎细胞因子TNFα(肿瘤坏死因子α)和IL-6(白细胞介素-6)水平仅在5个mTBIs最后一个后的48小时和8小时显著升高（图4c，d）。将rmTBI小鼠的GFAP、Iba1、TNFα和Il-6水平与最后一次假手术小鼠后48 h的GFAP、Iba1、TNFα和Il-6水平进行比较，确定rmTBI小鼠蛋白样品中GFAP、Iba1、TNFα和Il-6水平的升高。我们通过Western blot分析小鼠大脑中的蛋白质样本，在最后一次假手术后8小时和48小时，发现这些炎症标志物的水平在这些组之间没有差异（图S1），证明假手术的效果可以忽略不计。图4 重复性mTBI导致轻度炎症反应
Western blot和随后的密度分析显示了最后一次假手术后48小时、损伤后8小时、48小时和1周小鼠前额叶皮质中GFAP (a)、Iba1 (b)、TNFα (c)和IL-6 (d)水平的时间进程。(星号表示与假的统计差异，#表示与rmTBI 48 h，p＜0.05；单向方差分析)。代表性的免疫荧光显微照片显示对照(e)和小鼠在rmTBI后48 h(f)、1周(g)和10周(h)时胼胝体中GFAP和Iba1的表达。e’-h’插图中显示了更高倍数的Iba1免疫染色图像，以更好地显示相应时间点的小胶质细胞形态。 4. rmTBI诱发MRS和DTI的变化
rmTBI小鼠脑切片的银染显示，在最后一次5个mTBI后48小时到10周出现DAI。为了确定轴突损伤是否伴有脑白质改变，我们采用DTI技术，该技术对脑组织微结构和结构连通性的变化敏感。各向异性分数（FA）是一种DTI测量，被认为可以指示白质完整性。与对照组相比，受伤小鼠在损伤后48小时海马体和胼胝体的FA增加，在损伤后1周海马体的FA增加。在rmTBI小鼠中，损伤后48小时的胼胝体和海马体的FA水平高于损伤后4周和10周的。FA的这些变化是由径向扩散率的降低引起的（表1）。由于我们先前发现脑震荡和非脑震荡女性接触运动员MRS衍生代谢物水平的改变，我们使用MRS评估NAA、乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、肌酸、牛磺酸、胆碱、肌醇，以及与肌酸（X/Cr）的比值，使用以胼胝体中线为中心的36 mm³体素（表2）。N-乙酰天冬氨酸（NAA）在rmTBI后1周比rmTBI后48小时减少（Tukey多重比较检验，p=0.0185），与DTI测得的FA升高一致。此外，肌酸、牛磺酸、Glu/Cr和Gln/Cr的水平在10周时也有改变。对照组肌酸下降（Tukey多重比较试验，p=0.0106），而对照组、48小时和1周的牛磺酸均下降（Tukey， p=0.0266，p=0.0007，p=0.0128）。在10 w时，Glu/Cr比对照组（Tukey，p=0.0346）和1 w时（Tukey，p=0.0495）升高，而Gln/Cr比48 h时升高（Tukey，p=0.0451）（表2）。 表1 DTI感兴趣区域分析 表2 MRS绝对浓度和比值 
5. rmTBI导致突触重构的证据
损伤小鼠中DAI的存在表明，一定比例的损伤轴突可能已经足够损伤，从而导致轴突断开和突触丧失。为了研究rmTBI小鼠突触蛋白可能的变化，我们采用Western blot分析评估假手术和rmTBI小鼠PFC蛋白提取物中的突触素水平。该分析显示，损伤小鼠脑提取物中突触素水平在48小时和5个mTBIs最后一个20周时显著降低(图5a)。由于TBI会导致皮层兴奋和抑制的不平衡，我们预测改变突触数量减少突触素水平可能是因为兴奋谷氨酸水平和比例的变化和抑制GABAergic突触。为了研究这种可能性，我们评估了PSD95(谷氨酸末端的标记物)和Gephyrin(GABAergic末端的标记物)在假手术和损伤小鼠PFC中的水平。Western blot检测结果显示，5次mTBI损伤后8 h和48 h，损伤小鼠的PSD95水平较假体显著升高，48 h后，Gephyrin水平较假体显著降低(图5 b，c)。因此，PSD95水平的比值：与假体相比，在最后一次损伤后8和48小时，损伤小鼠的Gephyrin水平显著升高(图5d)。这表明至少在5个mTBIs的最后一个后48小时，rmTBI小鼠的PFC中兴奋性和抑制性突触存在不平衡。 图5 rmTBI后PFC突触蛋白水平的改变
用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离假手术组和rmTBI组小鼠PFC损伤后不同时间点的蛋白提取物，同时用抗体进行Western blot检测PSD95、Gephyrin、突触素和β-actin。将同一凝胶内（a）突触素、（b）PSD95和（c）Gephyrin蛋白带的相对光密度定量并用β-actin归一化。典型的免疫印迹如图d所示。伤后8 h和48 h，rmTBI小鼠PFC中PSD95:Gephyrin的比值升高。 6. rmTBI导致专注力减弱，但不影响认知灵活性
我们观察到的显著病理改变暗示rmTBI可能导致行为缺陷。许多研究报道mTBI患者表现出注意力下降、反应时间减慢以及认知灵活性降低，高水平的认知功能尚未在创伤性脑损伤小鼠模型中进行常规评估。因此，我们评估了rmTBI小鼠在PVD-R任务测量行为灵活性（依赖于皮层-纹状体功能）和5-CSRTT任务测量注意力控制（依赖于PFC功能的认知域）上的表现。我们用PVD-R任务研究了损伤小鼠的行为灵活性，即根据规则和偶然事件的变化改变行为的能力。在rmTBI或假手术后2周，我们将小鼠基线化（图6b中的B3），然后逆转刺激-奖赏偶发事件，并每天进行一次试验，持续10天（图6a-c）。在伤后6周，小鼠再次基线化，然后刺激奖赏转换回原来的奖赏模式，小鼠再次测试。如图6所示，rmTBI小鼠在rmTBI后基线（B3）上的表现与假手术组相同，表明rmTBI不影响执行先前学习的PVD任务的能力。在2周和6周时，rmTBI小鼠和假手术小鼠的PVD逆转表现也没有差异，表明rmTBI不影响行为灵活性。相反，我们发现注意力明显不集中。在损伤后2周，rmTBI和假手术小鼠之间的5-CSRTT表现没有差异（图6d）。然而，在损伤后6周，与0.8和0.6 s的刺激持续时间下的假手术小鼠相比，rmTBI小鼠执行该任务的准确性降低（图6e），而在10周时，rmTBI小鼠准确性的降低并不显著（尽管rmTBI小鼠的表现往往略差于对照组）（图6f）。假手术组小鼠和rmTBI小鼠在过早反应率（衡量冲动性的指标）或持续性反应率方面没有差异。假手术小鼠和rmTBI小鼠的遗漏率、奖赏收集潜伏期和正确触摸潜伏期也无显著性差异（均F<1，p>0.1）。因此，每隔一天进行5次mTBIs后，小鼠在伤后6周出现注意缺陷，在伤后10周有所改善。 图6 rmTBI后通过触摸屏测试发现的注意力缺陷，但不是视觉辨别
a-c配对视觉辨别。a任务获取：要求达到标准的试验（连续两天正确回答率>80%）。b所有小鼠在随机分为假手术组和损伤组之前，接受2次基线检查（B1，B2）。恢复2周后，将小鼠重新基线化2次（B3，B4），然后进行反向任务应急（先前的S+变成S；前一个S+持续10天（R1 R10）。比较假手术和rmTBI的准确性选择。c在rmTBI后6周，所有小鼠接受2次基线测试。然后，任务意外事件被再次反转（回到原来的S+和S）。对小鼠进行3次小试验（每天10次，R1-R3），然后进行10天的完整试验（每天20次，R4-R13）。比较两组的表现水平。d-f 5-选择系列反应时测试（5-CSRTT）性能探针试验，刺激持续时间为1.5、1.0、0.8和0.6秒。训练结束后，将小鼠随机分为假手术组和rmTBI损伤组。分别在rmTBI后2周（d）、6周（e）和10周（f）进行探针试验。 7. 重复的mTBI会导致空间记忆的缺失
我们和其他人在不同的mTBI模型中发现了小鼠空间认知和记忆的缺陷。我们用Morris水迷宫测试了损伤后16周rmTBI小鼠的空间认知能力。假手术小鼠和rmTBI小鼠在4天的训练中发现隐藏平台的潜伏期都有所减少，这表明rmTBI对空间学习没有显著影响（图7a）。在第5天进行的探针试验中，假手术小鼠在目标象限的时间明显多于其他象限，而mTBI组小鼠在目标象限的时间与在其他3个象限的平均时间相同（图7b，c）。这反映在rmTBI小鼠在探针试验期间第一次进入目标象限之前明显走得更远（图7d）。假手术小鼠（0.23±0.028m/s）和rmTBI小鼠（0.21±0.027m/s）的平均游泳速度差异不显著，这表明rmTBI小鼠存在空间记忆障碍。 图7 rmTBI小鼠的Morris水迷宫缺陷
在rmTBI后16周，所有小鼠连续训练4天（每天4次；平台位于象限4），并在第5天进行探针测试。a，在试验训练阶段，假手术小鼠和rmTBI小鼠的逃逸潜伏期没有差异（F（3108）=1.127，p=0.34）。b，在探针试验期间，假手术小鼠而非rmTBI小鼠在靶象限（Q4）花费的时间比在非靶象限（Q1-3）花费的平均时间多（F（3,48）=29.13，p<0.001）。一只老鼠在任何一个象限中偶然花费的时间（分配给试验的60个象限中的15秒）用虚线表示。c，假手术小鼠和rmTBI小鼠在第1天训练和探针试验中追踪的代表性运动；红点表示隐藏平台的位置（Q4）；黑星表示鼠标被释放到池中的位置。d，在探针试验期间，rmTBI小鼠比假手术小鼠走了更长的距离，直到它们第一次进入目标象限。 8. rmTBI导致病理性磷酸化tau蛋白水平增加
Tau是一种微管相关蛋白，对稳定微管蛋白聚合物非常重要，微管蛋白聚合物对于神经元结构、轴突运输和可塑性至关重要。Tau蛋白在TBI后发生病理性磷酸化，是一系列神经退行性疾病的神经病理学标志。考虑到rmTBI小鼠脑内银染和APP免疫反应显示的弥漫性轴突损伤，我们试图通过免疫组织化学使用识别过度磷酸化Tau的AT8抗体来确定rmTBI小鼠脑内Tau是否过度磷酸化。伤后1周，对照组（12-14周龄小鼠）和rmTBI小鼠的脑切片均未检测到AT8免疫反应（图8a，b）。然而，在损伤后4周和10周，我们在rmTBI皮层和海马的切片中发现AT8免疫反应明显（图8c，d）。对照组24周龄小鼠（损伤后10周龄的rmTBI小鼠为22-24周龄）的脑切片未能显示AT8免疫反应性（图8e），表明rmTBI小鼠的AT8免疫反应性不是由于衰老，而是由于他们经历的rmTBI。 图8 rmTBI后4周和10周病理性磷酸化tau
病理磷酸化tau（红色）的AT8免疫染色的代表性显微照片显示，虽然对照组（a-c）和损伤后1周（d-f）的rmTBI小鼠的脑切片未显示任何可检测到的AT8免疫染色，但皮质、CA1（用b、e、h、k和n中的虚线勾勒）和CA2/CA3区域（用c、f、i、l和o中的虚线勾勒）在rmTBI后4周和10周的小鼠中显示阳性AT8免疫染色（g-l）。为了更好地分析染色结构的形态，选择来自PFC的载玻片也使用DAB反应进行染色。高倍镜下这些染色切片（插图g）显示AT8免疫染色阳性的核周（白色箭头）和纤维（黑色箭头）。对照组小鼠24周龄（年龄与损伤后10周组相匹配）的皮层和海马切片的AT8免疫染色呈阴性，表明rmTBI后4周和10周组的AT8免疫染色并非由于年龄增加（m-o）。 9. rmTBI导致血液代谢物的显著变化
以前的研究表明，血浆代谢组学分析与机器学习相结合，可用于将打板球的男孩分为脑震荡组和非脑震荡组，准确率为92%。为了确定将有监督机器学习应用于小鼠代谢组学数据是否同样可用于将小鼠分为5种可能的类别之一（对照组、48小时、1、4或10周脑震荡后），我们收集了所有组小鼠的血样，并使用Biocrates试剂盒对其进行代谢组学筛选。我们利用Sklearn的StandardScaler软件包测量血液代谢物水平，应用随机森林分类器，使用所有144种代谢物、30棵树和150个深度的定标血液水平，将来自每只小鼠样品的代谢组学特征分类为对照组、损伤后48小时、1周、4周或10周。数据被随机洗牌并分成训练和测试数据，每个时间点使用8个样本作为训练数据，其余4个用于测试（每组n=12）。这种交叉验证（改组、拆分、训练和测试）使用20个随机状态对数据进行了20次，结果被汇编成混淆矩阵（图9a）。小鼠血液样本分类中，损伤后1周的小鼠样本的准确性为49%，损伤后10周的小鼠血液样本的准确率达到89%，这大大高于在5组中随机猜测分类时预期的20%的准确率。为了确定哪些代谢物可能在组间显示出统计上的显著差异，我们对所有144种代谢物的水平进行了Mann-Whitney U检验。在对多重比较进行Bonferroni校正后，我们发现26种代谢物有32个统计学意义。描绘这些代谢物表达水平变化的热图（图9b）表明，几乎所有在一个时间点在组与组之间发现有统计学差异的代谢物都是磷脂酰胆碱或溶血磷脂酰胆碱（23/26）。这些是我们先前发现的区分脑震荡和非脑震荡的曲棍球运动员的同一类磷脂，这些代谢物在损伤后都表现出非常相似的变化模式，在损伤后10周水平开始有所降低，然后显著升高。 图9 rmTBI后的长期代谢异常
a，使用随机森林分类器的混淆矩阵证明了代谢组学可用于将小鼠分类为对照组、rmTBI后48小时、1周、4周或10周的准确性。rmTBI后10天动物代谢组学分析的准确率最高（89%）。进行Mann-Whitney U检验，寻找每个代谢物的每对时间点之间的统计显著性差异。然后使用Bonferroni校正来校正家庭错误率。校正后，在26种代谢物中有32个点具有统计学意义。b，热图显示这些代谢物相对于对照水平的水平（黑色）。几乎所有的代谢物（23/26）都是磷脂酰胆碱或溶酶体磷脂酰胆碱，并且表现出相似的表达模式：rmTBI后早期低（蓝色），rmTBI后10周显著高（红色）。 10. rmTBI导致长期白质病变
在rmTBI后，我们的分析显示急性DAI伴有短暂的炎症反应。另一方面，行为测试显示损伤后6周（5-CSRTT）和16周（空间记忆）出现缺陷。为了研究mTBI小鼠损伤后20周可能的长期病理变化，我们对接受5-CSRTT的假手术小鼠和rmTBI小鼠进行了超微结构分析。我们使用Image Pro软件，从假手术小鼠和rmTBI（每组6只）小鼠的胼胝体中，测量落在每个电子显微照片中叠加网格线上的轴突的平均髓鞘厚度（图10a、b、d、e）。rmTBI小鼠的平均髓鞘厚度显著降低（图10c），电镜检查提示rmTBI小鼠胼胝体脱髓鞘纤维增多。因此，我们对电子显微照片中的脱髓鞘和有髓鞘纤维进行了手工计数，发现虽然假手术小鼠和rmTBI小鼠胼胝体单位面积内轴突的数量没有差异，但rmTBI小鼠中脱髓鞘轴突的数量和百分比明显更大（图10f-h）。我们在rmTBI小鼠的切片中也经常发现其他白质超微结构异常，包括髓鞘失活、附睾间隙增加和轴突变性（图10i-l）。 图10 伤后20周，电镜下观察胼胝体凹陷区长期白质病理改变
a，假手术动物的轴突致密，大部分有髓。b，在rmTBI小鼠中轴突较不紧密，有分散的变性轴突和脱髓鞘轴突。c，rmTBI小鼠的髓鞘平均厚度显著降低。d、e，假手术和rmTBI切片中发现脱髓鞘轴突（直径>0.3 mm，未检测到致密髓鞘）（浅黄色）。f假手术组小鼠和rmTBI组小鼠轴突总密度无明显差异。g、h，然而，在rmTBI样本中，脱髓鞘轴突的密度和百分比显著增高。i，胼胝体的代表性电子显微照片显示失代偿的各种异常（箭头）；营养不良轴突（星号）；脱髓鞘轴突（浅黄色）和髓鞘与轴突分离（箭头）。胼胝体冠状切片显示假轴突细胞骨架结构均匀（j）；rmTBI后，变性轴突（k，红色箭头）和髓鞘失代偿（l，黄色箭头）出现囊泡堆积。

讨论

我们利用预测的类似于人类的亚慢性损伤的损伤严重程度来描述rmTBI在小鼠中的短期和长期病理学和行为学后果。本研究中使用的mTBI产生的适度线性和角加速度分别为14.0±2.2 g和36.6±24.5 krad/s²。相比之下，小鼠TBI的嵌合体模型产生524 g的线性加速度和149 krad/s²的角加速度。遵循等压等速关系，比例因子为λ = (人脑质量/小鼠脑质量)^1/3=13.8，我们估计等效人体损伤的峰值线性加速度为1.0±0.2 g，峰值角加速度为0.2±0.1 krad/s²。这些线性和角加速度大约比人类运动相关脑震荡中报告的平均线性加速度（大于40 g）和峰值角加速度（5.022 krad/s²）小40倍。在一项使用这种mTBI模型的初步研究中，我们发现单个mTBI在mTBI后1周通过银染未能显示损伤小鼠胼胝体中的任何弥漫性轴突损伤。因此，我们判断我们的rmTBI模型是非常轻微的，可能代表了人们的潜意识伤害。因此，为了研究重复性病灶下头部损伤的小鼠模型，我们将小鼠进行5次mTBIs（每天一次，连续5天），预测其只会产生急性和轻微的病理和行为缺陷。与该预测一致，在我们的rmTBI小鼠中观察到许多急性病理变化是短暂的。rmTBI小鼠切片的银染和APP免疫反应显示，损伤小鼠确实有DAI的体征，但DAI的体征随着时间的推移有改善的趋势。因此，损伤小鼠胼胝体的银染在损伤后1周最为强烈，但在损伤后10周下降。同样地，APP免疫染色在伤后48 h和1周最为明显，但在伤后4周基本不表达。我们在rmTBI后观察到强烈的银染色，而在单个mTBI后没有观察到，表明，当至少间隔一天时，多个mTBI有累积效应。DTI研究证实了DAI的短暂性，即损伤后海马和胼胝体FA急剧增加，损伤后4周恢复到基线水平。rmTBI小鼠的炎症反应是短暂的，Western blot分析显示， GFAP和Iba1的表达（分别反映星形胶质细胞和小胶质细胞的激活）在5次mTBIs的最后一个8小时时高于假手术水平2倍，但在损伤后48小时恢复到基线水平。促炎细胞因子（TNFα和IL-6）表达也只有在损伤后1周时才出现急性升高的现象，且能恢复到基线水平。这种炎症反应的短暂性与在更严重的单一和重复的mTBI模型中观察到的更持久的炎症反应形成对比，进一步证明了目前损伤模型的温和性。银染显示的DAI，特别是在胼胝体部分切片中观察到的银染螺旋状轴突，使我们推测损伤可能导致轴突终末与其突触靶点之间的断开。为了支持这一预测，突触素水平在rmTBI后急剧下降，这种变化在损伤后20周仍很明显。PSD95水平的急性升高和Gephyrin水平的降低可能表明兴奋性和抑制性突触比率的改变，这也被认为是在TBI后发生的。我们不能排除突触素、PSD95和Gephyrin水平的变化是由于蛋白质表达水平的变化，而不是突触数量的变化。然而，其他研究表明，神经末梢可以通过这些神经末梢标记物的水平来量化，这些结果肯定表明了损伤引起的突触可塑性和重塑的增加。这些数据表明，rmTBI后，抑制性突触暂时丧失功能，兴奋性突触再生更为强劲，导致兴奋性：抑制性活动比率暂时增加。损伤后皮层兴奋性和抑制性活动平衡的改变已经被其他人描述过，许多人表现出抑制性突触活动的特异性丧失。rmTBI后1周，PSD95和Gephyrin水平恢复到基线水平，从而恢复兴奋性和抑制性突触活动的平衡。然而，损伤诱导的重塑似乎也可能没有使单个回路恢复到损伤前的状态。此外，突触素水平的长期降低表明rmTBI导致的突触整体丢失，即使在损伤后20周也不能完全补偿。个别电路重构的改变和/或缺陷可以解释在这个实验范式中观察到的认知和行为的长期变化。在目前的研究中，体内DTI后的区域分析显示，包括海马和胼胝体白质在内的体积中FA的瞬时增加和RD的短暂减少。体重下降后，大鼠胼胝体和海马体的FA增加也有类似的报道。此外，在人类mTBI中也报道了胼胝体中FA的增加。这些变化通常与神经炎症或髓鞘再生有关。在本研究中，FA的增加可能归因于western blot和免疫组化分析确定的短暂性神经炎症。我们在rmTBI小鼠中观察到的FA增加也可能归因于急性星形胶质细胞增生，损伤后8小时GFAP水平增加，其他人认为星形胶质细胞增殖是TBI后FA增加的主要原因。虽然损伤后4周，rmTBI损伤引起的DAI和炎症反应或得到缓解或显著改善，但行为测试和MRS提示损伤的长期后果。5-CSRTT在损伤后6周的rmTBI小鼠中显示出注意缺陷，损伤后10周改善。虽然我们没有观察到假手术小鼠和rmTBI小鼠在PVD-R上的任何差异，但其他人报告了rmTBI小鼠在这项任务中的缺陷。在他们的研究中，Pinkowski等人首先将小鼠暴露于rmTBI（4 mTbis，每天一次，持续4天），然后两天后开始PVD训练。rmTBI小鼠在使用这种范式学习这项任务时有很大困难。在本研究中，我们首先对小鼠进行PVD训练，直到它们连续2天达到80%正确选择的标准，然后随机分为假手术组和rmTBI组。因此，虽然Pinkowski等人的工作测试了学习PVD任务是否受到rmTBI的影响，但我们的研究范式测试了rmTBI是否影响执行已经学习的PVD任务的能力，以及当规则在已经学习的PVD任务中改变时，rmTBI是否影响认知灵活性。我们的研究结果清楚地表明，rmTBI既不影响已经学习的PVD任务的表现，也不影响认知灵活性。在rmTBI小鼠中发现的注意缺陷而不是行为灵活性表明，与人类脑震荡的情况一样，rmTBI具有相当微妙的、高水平的认知缺陷，可能存在于一个认知领域，但不存在于其他认知领域。rmTBI小鼠认知缺陷的特异性可能是由于损伤的位置或其严重程度所致，但可能在这些不同认知功能的特定回路的病理学背景下可以得到更好的理解。由于PFC已被证明对注意力任务的表现至关重要，并且我们的分析表明rmTBI特别在PFC中触发了突触重塑，我们认为这些重塑可能会损害小鼠的注意力。伤后16周Morris水迷宫实验也显示rmTBI小鼠存在迟发性认知缺陷。在这项空间记忆测试中，rmTBI小鼠的实验显示，他们能够在训练期间学习隐藏平台的位置，而假对照组小鼠在探测试验期间，他们在第二天记忆任务方面存在缺陷。另一些人在更严重的mTBI模型中使用Morris水迷宫也显示出长期的空间认知缺陷。我们在体内MRS测量中也观察到了延长的变化，例如，与损伤后48小时相比，在10周时观察到乳酸减少。由于缺氧/缺血条件的存在，TBI中的乳酸水平已经显示出增加。研究还表明，利用Morris水迷宫，抑制小鼠大脑中乳酸的产生会导致空间学习和记忆受损。因此，损伤后10周MRS观察到rmTBI小鼠海马乳酸水平较低，可能是其空间记忆能力差的原因。伤后10周内，Glu/Cr和Gln/Cr比值增加。当代谢物水平向相反方向移动时，代谢物比率可能对细微变化高度敏感，但解释这些变化目前具有一定难度。Gln/Cr的显著增加可能是由于谷氨酰胺的少量增加以及伴随的肌酸的减少。此外，Gln/Cr水平的这种变化与之前对大学橄榄球运动员与非接触运动员进行比较的研究中观察到的结果是一致的。我们推测，本研究中使用的5种mTBIs范式可能模拟运动员在一个赛季的比赛中接触到的冲击条件，最终导致谷氨酰胺水平升高。rmTBI小鼠在损伤后DAI和炎症标志物下降或已处于基线水平时出现认知缺陷的观察表明，最初的损伤可能触发了随时间恶化的病理过程。rmTBI组病理性磷酸化tau水平随时间延长而升高；对照组和rmTBI小鼠在伤后1周未检测到AT8荧光蛋白tau的免疫染色，但在伤后4周和10周取的rmTBI脑切片中检测到增加，而在与rmTBI后10周小鼠年龄相匹配的小鼠中未检测到AT8磷酸化tau免疫染色。病理性磷酸化tau的持续增加已在其他小鼠rmTBI模型中观察到，在目前的rmTBI模型中，tau磷酸化随时间增加的发现让人想起人类脑震荡，在这种震荡中，磷酸化tau被认为是慢性创伤性脑病（CTE）的标志，慢性创伤性脑病是一种与反复轻度TBI病史相关的痴呆形式。除了在损伤后的慢性时间点发现病理性磷酸化tau外，我们还发现rmTBI后20周出现白质损伤的证据。白质的超微结构变化包括髓鞘厚度的减少和髓鞘化的轴突百分比的减少，尽管轴突数量与假体没有区别。此外，我们观察到，在rmTBI小鼠胼胝体中，髓鞘被分解、磨损，在许多情况下，髓鞘被从轴突上拉走，形成了一个增大的轴突空间。也有许多轴突变性的例子，表现为囊泡的积聚。在损伤后的早期时间点，脑震荡小鼠在超微结构水平上表现出这些类型的白质和轴突病变，并证明小鼠反复mTBI可导致白质病变，即使在损伤后20周也无法解决。认知测试、MRS、突触标志物western blot分析、超微结构分析和磷酸化tau免疫组织化学共同表明，即使是异常轻微的反复TBIs也会导致大脑的长期变化，并随时间恶化。代谢组学数据支持这一观点。使用随机森林分类器，我们能够证明血液中的代谢特征可用于将小鼠分类为对照组或损伤后48小时、1周、4周或10周，准确率在49%到89%之间，这些分类准确率远远好于概率（20%）。此外，我们发现磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱构成了26种代谢物中的23种，这些代谢物至少在研究的一个时间点上存在统计差异。磷脂酰胆碱已被证明在人类脑震荡的分类中很重要，它们在rmTBI小鼠中的协同表达模式表明，这种代谢物家族在损伤后受到协同调节。事实上，所有这些代谢物在损伤后10周时在统计学上显著上调，这加强了这样一种观点，即重复的mTBI导致长期变化，这些变化不会解决基线问题，但可能会随着时间的推移继续演变，或者演变，直到建立一个新的mTBI后基线，超出了本文研究的时间点。在人类脑震荡中所报告的认知和病理变化与我们在目前的rmTBI小鼠模型中所描述的认知和病理变化之间有许多相似之处。例如，对于脑震荡患者来说，注意力和记忆缺陷是众所周知的挑战，而在rmTBI小鼠中则是不足的。rmTBI小鼠在48小时（胼胝体和海马）和脑震荡后1周（海马），DTI显示分数各向异性（FA）增加，这是白质病理学的一个指标。这些结果反映了大多数脑震荡运动员DTI研究的结果，这些研究也显示FA早期增加。在目前的研究中，FA的增加和RD的减少也与我们以前在非脑震荡接触运动运动员中的发现一致。具体来说，我们观察到女性橄榄球运动员经过一个赛季的接触性比赛后，MRS体素白质内FA增加，RD减少。Gln/Cr的变化与FA和RD在运动季节的变化之间存在相关性。在目前的研究中，我们观察到谷氨酰胺和RD在10周时有相似的相关性。rmTBI小鼠的神经病理学研究也表明与人类脑震荡的神经病理学相似。例如，rmTBI脑切片的银染和抗APP染色显示，DAI最早可在rmTBI后48小时（分析的最早时间点）检测到，并持续数周。脑外伤后APP的积聚是人类DAI的一个众所周知的诊断特征。最后，rmTBI小鼠中病理性磷酸化tau的积聚反映在人类身上，观察到人类急性TBI后，tau水平和tau磷酸化增加。在TBI的长期存活者中，34%的受检者表现出tau病变，而年龄匹配的对照组为9%。此外，磷酸化tau的聚集被认为是慢性创伤性脑病（CTE）的标志，CTE是一种与反复轻度TBI（包括冲击伤引起的TBI）相关的痴呆。 

结论

本文所描述的rmTBI小鼠模型是非常温和的，根据损伤时的运动学测量和损伤所引发的炎症的瞬时性质来判断。同时，我们的rmTBI模型导致了认知缺陷、白质病理改变、病理性磷酸化tau水平升高以及损伤后持续数月的代谢物水平变化。这里使用的rmTBI可能没有运动学测量结果显示的那么轻微，而且小鼠和人类之间白质与灰质的比率、大脑和头骨的几何结构或皮质脑回的存在的差异混淆了我们在人类和小鼠之间适当衡量TBI的能力。这一论点表明，我们在仅根据运动学测量将人类创伤性脑损伤缩小到小鼠时需要非常谨慎，其他神经病理学生物标志物，如认知功能，以及白色和灰色损伤的测量需要进一步精确。然而，本文所描述的rmTBI模型引发的适度且短暂的炎症反应支持这样的解释：rmTBI确实是轻微的，但尽管如此，它们还是引发了病理生理学变化，这种变化随着时间的推移而演变并持续数月。当外推到人类病例时，这些发现表明，如果一个人经历rmTBIs，无论他们是否被诊断为脑震荡，损伤的重复性可能触发病理过程，并产生长期的病理和认知后果。这一预测得到了我们自己的研究的支持，这些研究显示了非脑震荡女性橄榄球运动员的功能磁共振成像、DTI和MRS的长期变化。这也得到了运动员认知障碍的研究结果的支持，这些运动员被认为没有脑震荡。这项工作使人们注意到，过度的mTBIs可能会不易被诊断，但仍然会引发病理后果，这种后果可能要到很久以后才会显现出来。因此，所描述的小鼠模型可能有助于研究rmTBI的影响，rmTBI可能最常见于伴随常规接触运动的未诊断的mTBI。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33823944/

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